A ditiotreitol (DTT) egy gyakran használt redukálószer, más néven az új zöld adalékanyag. Kis molekulájú szerves vegyület, két merkaptáncsoporttal (-SH). Redukáló tulajdonságai és stabilitása miatt a DTT-t széles körben használják biokémiai és molekuláris biológiai kísérletekben.
A DTT fő szerepe a fehérjékben és más biomolekulákban található diszulfidkötések csökkentése. A diszulfidkötés fontos része a fehérjehajtogatásnak és stabilitásnak, de bizonyos kísérleti körülmények között, például a redukálható SDS-PAGE analízis, a fehérje rekombinációja és hajtogatása során, a diszulfidkötést két tiolcsoportra kell redukálni a fehérje térbeli szerkezetének felbontásához. A DTT reakcióba léphet a diszulfidkötésekkel, merkaptáncsoportokká redukálva azokat, ezáltal megnyitva a fehérje térbeli szerkezetét, és megkönnyítve az elemzést és a manipulációt.
A DTT az enzimaktivitás és -stabilitás védelmére is használható. Egyes enzimkatalizált reakciókban az oxidálószer csökkentheti az enzim aktivitását. A DTT reakcióba léphet az oxidálószerekkel, ártalmatlan anyagokká redukálva azokat, ezáltal védve az enzim aktivitását és stabilitását.
A hagyományos redukálószerekhez, például a β-merkaptoetanolhoz (β-ME) képest a DTT biztonságosabb és stabilabb redukálószernek tekinthető. Nemcsak vizes oldatban stabil, hanem magas hőmérsékleten és savas-bázis körülmények között is megőrzi redukáló tulajdonságait.
A DTT használata viszonylag egyszerű. Általában a DTT-t megfelelő pufferben oldják fel, majd hozzáadják a kísérleti rendszerhez. A DTT optimális koncentrációját az adott kísérletnek megfelelően kell meghatározni, és általában 0,1-1 mM tartományban alkalmazzák. Az alacsonyabb koncentrációk csökkenthetik a sejtnövekedésre gyakorolt káros hatásokat, és csökkenthetik a célfehérjék túltermelése miatti citotoxicitást. A magasabb koncentrációk túlzott sejtanyagcsere-terhelést okozhatnak, ami befolyásolhatja a sejtnövekedést és az expressziós hatékonyságot.
Az optimális koncentráció meghatározásának módja lehet a célfehérje expressziós szintjének értékelése IPTG indukciós tesztek elvégzésével különböző koncentrációkon. Kisléptékű tenyésztési tesztek végezhetők az IPTG koncentrációk széles tartományával (pl. 0,1 mM, 0,5 mM, 1 mM stb.), és a különböző koncentrációk expressziós hatása a célfehérje expressziós szintjének detektálásával értékelhető (pl. Western blot vagy fluoreszcencia detektálás). A kísérleti eredmények alapján a legjobb expressziós hatást mutató koncentrációt választottuk optimális koncentrációnak.
Ezenkívül a vonatkozó szakirodalomra vagy más laboratóriumok tapasztalataira is hivatkozhat, hogy megértse a hasonló kísérleti körülmények között általánosan használt IPTG koncentrációtartományt, majd optimalizálja és állítsa be a kísérleti igényeknek megfelelően.
Fontos megjegyezni, hogy az optimális koncentráció változhat a különböző expressziós rendszerektől, célfehérjéktől és kísérleti körülményektől függően, ezért a legjobb eseti alapon optimalizálni.
Összefoglalva, a DTT egy gyakran használt redukálószer, amely felhasználható a fehérjékben és más biomolekulákban lévő diszulfidkötések csökkentésére, valamint az enzimaktivitás és stabilitás védelmére. Széles körben alkalmazzák biokémiai és molekuláris biológiai kísérletekben.
Közzététel ideje: 2023. szeptember 28.