Az IPTG (izopropil-β-D-tiogalaktozid) a β-galaktozidáz szubsztrát analógja, amely nagymértékben indukálható. Az IPTG indukciója alatt az induktor komplexet képezhet a represszorfehérjével, így a represszorfehérje konformációja megváltozik, így az nem kombinálható a célgénnel, és a célgén hatékonyan expresszálódik. Tehát hogyan kell meghatározni az IPTG koncentrációját a kísérlet során? Minél nagyobb, annál jobb?
Először is, értsük meg az IPTG indukciójának elvét: az E. coli laktóz operonja (eleme) három strukturális gént tartalmaz, Z-t, Y-t és A-t, amelyek rendre β-galaktozidázt, permeázt és acetiltranszferázt kódolnak. A lacZ a laktózt glükózzá és galaktózzá, vagy allo-laktózzá hidrolizálja; a lacY lehetővé teszi, hogy a környezetben lévő laktóz átjusson a sejtmembránon és bejusson a sejtbe; a lacA az acetilcsoportot az acetil-CoA-ról a β-galaktozidra viszi át, ami a toxikus hatás megszüntetését jelenti. Ezenkívül létezik egy O operációs szekvencia, egy P kezdő szekvencia és egy I szabályozó gén. Az I gén kódja egy represszorfehérje, amely az operátor szekvencia O pozíciójához kötődhet, így az operon (meta) represszálódik és kikapcsol. Van egy kötőhely a katabolikus génaktivátor fehérje-CAP kötőhely számára is az iniciációs P szekvencia előtt. A P szekvencia, az O szekvencia és a CAP kötőhely együttesen alkotja a lac operon szabályozó régióját. A három enzim kódoló génjeit ugyanazon szabályozó régió szabályozza, hogy elérje a géntermékek összehangolt expresszióját.
Laktóz hiányában a lac operon (meta) repressziós állapotban van. Ekkor a PI promoter szekvencia szabályozása alatt az I szekvencia által expresszált lac represszor az O szekvenciához kötődik, ami megakadályozza az RNS polimeráz P szekvenciához való kötődését és gátolja a transzkripció iniciációját; laktóz jelenlétében a lac operon (meta) indukálható. Ebben az operon (meta) rendszerben az igazi induktor nem maga a laktóz. A laktóz bejut a sejtbe, és a β-galaktozidáz katalizálja allolaktózzá alakulását. Ez utóbbi, mint induktor molekula, a represszor fehérjéhez kötődik, és megváltoztatja a fehérje konformációját, ami a represszor fehérje disszociációjához vezet az O szekvenciáról és a transzkripcióhoz. Az izopropil-tiogalaktozid (IPTG) ugyanolyan hatású, mint az allolaktóz. Nagyon erős induktor, amelyet a baktériumok nem metabolizálnak, és nagyon stabil, ezért széles körben használják a laboratóriumokban.
Hogyan határozható meg az IPTG optimális koncentrációja? Vegyük például az E. colit.
A pozitív rekombináns pGEX-et (CGRP/msCT) tartalmazó, genetikailag módosított E. coli BL21 törzset 50 μg·mL-1 Amp-et tartalmazó LB folyékony táptalajba oltottuk, majd 37°C-on tenyésztettük egy éjszakán át. A fenti tenyészetet 10 üveg 50 ml friss, 50 μg·mL-1 Amp-et tartalmazó LB folyékony táptalajba oltottuk 1:100 arányban a szaporítókultúra céljából, és amikor az OD600 érték 0,6~0,8 volt, IPTG-t adtunk hozzá a végső koncentrációig. Ez 0,1, 0,2, 0,3, 0,4, 0,5, 0,6, 0,7, 0,8, 0,9, 1,0 mmol·L-1. Azonos hőmérsékleten és időben történő indukció után 1 ml baktériumoldatot vettünk ki, a baktériumsejteket centrifugálással összegyűjtöttük, majd SDS-PAGE analízisnek vetettük alá a különböző IPTG-koncentrációk fehérjeexpresszióra gyakorolt hatásának elemzése céljából, majd kiválasztottuk a legnagyobb fehérjeexpressziót mutató IPTG-koncentrációt.
Kísérletek után kiderül, hogy az IPTG koncentrációja nem a lehető legnagyobb. Ez azért van, mert az IPTG bizonyos mértékben toxikus a baktériumokra. A koncentráció túllépése szintén elpusztítja a sejtet; és általánosságban elmondható, hogy minél több oldható fehérje expresszálódik a sejtben, annál jobb, de sok esetben, amikor az IPTG koncentrációja túl magas, nagy mennyiségű zárvány képződik. Test, de az oldható fehérje mennyisége csökken. Ezért a legmegfelelőbb IPTG koncentráció gyakran nem a minél nagyobb, annál jobb, hanem minél alacsonyabb a koncentráció.
A genetikailag módosított törzsek indukciójának és tenyésztésének célja a célfehérje hozamának növelése és a költségek csökkentése. A célgén expresszióját nemcsak a törzs saját faktorai és az expressziós plazmid befolyásolják, hanem egyéb külső körülmények is, mint például az induktor koncentrációja, az indukciós hőmérséklet és az indukciós idő. Ezért általánosságban elmondható, hogy egy ismeretlen fehérje expressziója és tisztítása előtt a legjobb az indukciós idő, a hőmérséklet és az IPTG koncentrációjának vizsgálata a megfelelő körülmények kiválasztása és a legjobb kísérleti eredmények elérése érdekében.
Közzététel ideje: 2021. dec. 31.